2023年6月4日，Advanced Science以Research Article形式在线发表365在线体育(中国)有限责任公司刘天罡教授团队联合国民核生化灾害防护国家重点实验室蒋辉研究员团队、365在线体育365在线体育沈坤副教授团队、天津大学姚明东副研究员团队合作完成的题为“Systematic mining and evaluation of the sesquiterpene skeletons as high energy aviation fuel molecules”（高能航空燃料分子倍半萜骨架的系统挖掘与评价）的研究。本论文以365在线体育(中国)有限责任公司黄阳磊博士和叶紫玲博士、国民核生化灾害防护国家重点实验室万秀坤博士和姚戈博士为共同第一作者。刘天罡教授、蒋辉研究员、沈坤副教授为共同通讯作者，该研究工作由国家重点研发计划“合成生物学”专项项目资助。

生物燃料是指由生物体组成或者转化形成的燃料，由于其不受化石资源的限制、绿色环保的特点受到越来越多的关注，在生物燃料候选化合物中，倍半萜化合物，具有高能量密度、高燃烧热和低冰点特性，被认为是未来新型的高能液体燃料，然而其应用于航空燃料领域的可行性分析仍处于理论阶段，仅通过分子结构特征预测燃料性能并不能得到准确的结果，这限制了倍半萜类化合物作为航空燃料的应用，将生物合成倍半萜制备出来进行实际的性能测试，对预测值进行佐证和校准，才能消除预测误差，推动倍半萜化合物从研发到应用的转化。基于此背景，该研究系统性评估预测了倍半萜分子作为高能液体燃料的相关性能，筛选有潜力的化合物进行生物合成制备，纯化以及实际性能测试，这在倍半萜作为生物燃料的挖掘、生产以及应用上具有十分重大的意义。

该研究首先进行了倍半萜化合物的燃料性能参数预测，从现有文献报道中收集了122种倍半萜骨架化合物，包括无环化合物1个、单环化合物有4个、双环化合物51个、三环化合物60个以及四环化合物6个，将122个化合物进行饱和化处理，结合基团贡献法和高斯量子化学方法，对化合物的体积热值、燃烧值、密度、冰点、闪点、比冲等6种性能参数进行计算评估，根据不同性能筛选标准，筛选出17个具有良好预测性能的倍半萜化合物（图1）。

图1 倍半萜化合物的性能预测

进一步地，该研究在酿酒酵母中实现了上述17个化合物的生物合成，以质粒形式将双向启动子P_GAL1-P_GAL10控制表达的倍半萜合酶基因、法尼基焦磷酸合酶基因（ERG20）导入至前期开发的高效酿酒酵母MVA底盘菌株JCR27中（图2），构建得到的菌株进行96孔板发酵培养，并通过GCMS分析检测产物组成，最终结果表明，其中7个化合物（α-farnesene, pentalenene, presilphiperfol-1-ene, epi-isozizaene, protoilludene, α-santalene以及β-copaene）产物组成简单且在GCMS检测峰图中有较高的强度，被挑选用于进一步地改造；另外，Thujopsene和α-barbatene两个候选化合物，可在同一个突变菌株中同时合成，也被挑选出来。剩余8个化合物，则由于峰响应值较低或者产物组成复杂提取困难等原因，不利于后期应用，因此不考虑进行后续的研究。

图2 倍半萜合成酶的快速表征

在筛选得到了9个倍半萜化合物的基础上，进一步优化菌株生物合成途径，通过调整关键基因拷贝数、增加前体供应以及平衡代谢流的方法，构建得到了9个化合物的高效合成菌株，其中，含单拷贝protoilludene合酶的菌株、双拷贝pentalenene、α-santalene、thujopsene、α-barbatene以及β-copaene合酶的菌株、三拷贝α-farnesene、presilphiperfol-1-ene以及epi-isozizaene合酶的菌株，在优化过程中对应产物摇瓶发酵水平最高（图3）。

随后，该研究将9个倍半萜产物对应高产菌株进行15 L分批补料发酵，通过控制溶氧、PH、温度、残糖以及乙醇浓度等参数，进一步提升了菌株生产9个化合物的能力，最终实现了10.8 g/L pentalenene, 22.7 g/L presilphiperfol-1-ene, 4.7 g/L epi-isozizaene, 38.8 g/L α-farnesene, 12.1 g/L protoilludene, 10.2 g/L α-santalene, 6.8 g/L β-copaene, 1.6 g/L α-barbatene以及1.2 g/L thujopsene的发酵产量（图4），9个化合物通过精馏进行了分离纯化，其中三个倍半萜Presilphiperfol-1-ene，pentalenene以及α-farnesene由于发酵产量以及纯度较高，被选择进行后续的研究。

该研究将Presilphiperfol-1-ene，pentalenene以及α-farnesene进行了氢化反应，得到了Presilphiperfol-1-ane，pentalenane以及farnesane，进行了体积热值、燃烧值、密度、冰点的实际测试，结果见表1，与传统高能液体燃料JP-10相比，尽管法尼烷具有较高的燃烧热，但其低密度导致其体积热值较低，相同燃料箱体积下释放能量较低，这将限制法尼烷作为潜在航空燃料的候选。Presilphiperfol-1-ane体积热值（39.24MJ/L）与JP-10相似，表明其具有作为新型航空燃料的潜力，值得注意的是，在20°C下，Presilphiperfol-1-ene呈现固体状态，但Presilphiperfol-1-ane呈现液体状态，这表明氢化前后该倍半萜化合物可以应用于不同使用场景（固体液体燃料）。pentalenane体积热值高于JP-10，表明其作为高能喷气燃料具有巨大的潜力。冰点预测值不准确，预测方法可以在后续研究中进一步优化。最后，具有最佳性能参数的pentalenane还进行了环丙烷化反应，经过测试，环丙烷化后相关性能参数并没有优于反应前，但倍半萜烯不饱和双键赋予了化合物更多化学修饰的可能性，有望可以在现有的基础上进行有计划改造从而获得想要的性能。

综上所述，该研究系统评估了倍半萜作为高能航空燃料的潜力，展示了通过结合计算和实际测试的方法来挖掘高能液体燃料的过程，这对于倍半萜实际应用于燃料领域具有十分重要的指示作用，仅通过理论测算，其应用将永远停留在理论可行的阶段，我们无法预见到实际使用过程中可能遇到的问题，法尼烷被认为是很好的航空燃料替代品，该研究发现了法尼烷的密度较低，尽管无法否认法尼烷仍具有比较优良的其他性能，但是这的确会限制其应用的范围；Presilphiperfol-1-ene也正是在实际测试过程中被发现可通过氢化反应应用于两种不同燃料应用场景之中，pentalenane尽管之前也曾有报道预测其具有成为液体燃料的潜力，但其更确切的优良性能参数也是通过实际测试才得以被发现和证实。另一方面，尽管冰点预测数值不准确，但这说明了仅通过理论测算得出的结果存在一定的局限，进一步证明了实际测试校正预测数值的重要性。尽管以葡萄糖为碳源的生物合成倍半萜成本仍高于传统燃料，但生物合成倍半萜烯赋予的燃料性质多样性将为生物燃料的发展创造更多可能性，并将为碳中和战略和燃料领域发展引导一个全新的方向。